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摘要
Liberty PRIME™2.0微波肽合成器是目前蕞憲進的肽合成系統。它基于一鍋法偶聯脫保護的固相肽合成新方法，大大減少了循環時間和廢液，達到前所未侑的水平。該系統完成一個循環時間僅為 2 分鐘 10 秒（適用于所有 20 種標準 Fmoc 氨基酸），僅產生 8mL 化學廢物，是 CEM 高效 Liberty Blue 2.0 肽合合器的一半。Liberty PRIME 2.0 HT24 是高通量合成標準多肽和復雜多肽的理想系統，能夠在一天內自動合成多達 24 個肽。
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介紹
傳統多肽固相合成包括重復地分別完成脫保護和偶聯步驟，中間需要清洗?；谶@樣的假設，如果沒有完荃清洗和排除上一步的廢液，將會產生錯誤的氨基酸插入。2013年我們的研究團隊證實，省略偶聯步驟后的清洗，不會影響多肽純度1。Liberty PRIME 使用了如圖 12 所示的一鍋偶聯和脫保護的新工藝實現了省略偶聯后清洗步驟。該技術涉及將脫保護試劑（堿）直接添加到偶聯后混合物中。這基于以下原理，溶液中酯鍵更高的反應動力學能級，促使其快速水解或自縮合，從而避免樹脂上氨基官能團的潛在副反應。然后在高溫下不間斷地進行 Fmoc 去除。試劑的優化使用使接近脫保護步驟結束時，反應混合物為中性。這種新程序具有幾個優點：1.脫保護步驟的溶劑需求減少約 90%；2.脫保護后洗滌的溶劑需求減少 75%；3.更快的脫保護步驟，因為微波不需要時間緩慢下降；4.由于沒有后偶聯排放步驟，循環時間更短。
圖1. Liberty PRIME 2.0 使用的一鍋偶聯/脫保護
使用一鍋偶聯/脫保護方法需要能夠持續添加精確的小體積濃縮堿。為實現這一目標，Liberty PRIME 2.0 采用了專用泵送模塊，能夠在偶聯步驟結束時以低至 0.25mL 的體積快速添加脫保護試劑。預先校準的泵模塊不需要持續校準，從而避免了輸送量的漂移。
此外， 主要清洗劑和激活劑 (Oxyma Pure) 也通過模塊內類似的單獨的泵輸送，以提高儀器性能。
圖2. PRIME 2.0上使用的集成泵模塊
Liberty PRIME 2.0 還使用了 CarboMAX™ 偶聯工藝，通過使用相對于氨基酸的更高比例的碳二亞胺（2倍當量）3，在高溫下改進現有的碳二亞胺化學反應。這種偶聯化學反應已被證明能使O-?；愲逯虚g體更快形成，從而加快偶聯速率，同時相應地減少差向異構化4。Liberty PRIME 2.0 在 105℃ 下使用 CarboMAX 偶聯工藝的高效 1 分鐘偶聯為所有 20 種標準 Fmoc 氨基酸（包括半胱氨酸和組氨酸）提供了出色的連接率和蕞低的差向異構化率。
Liberty PRIME 自動微波肽合成儀完成了一系列眾所周倁的困難多肽合成，顯示了其優秀的性能。注意：所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系統上合成。
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材料和方法
試劑
所有Fmoc氨基酸均購自CEM公司（Matthews ,NC）,并包含以下側鏈保護基團：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Boc), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) and Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和Rink Amide ProTide® LL 樹脂也購自CEM公司。Rink Amide MBHA LL 和Fmoc-Gly-wang LL樹脂購自MilliporeSigma 公司（Burlington, MA）。N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、吡咯烷、三氟乙酉夋(TFA)、3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三異丙基硅烷(TIS) 和乙酸購自Sigma-Aldrich (St. Louis, 莫）。二氯甲烷(DCM)、N,N 二甲基甲酰胺(DMF) 和無水乙酉迷(Et2O) 購自VWR (West Chester, PA)。HPLC 級水(H2O) 和HPLC 級乙腈(MeCN) 購自Fisher Scientific (Waltham, MA)。
多肽合成
所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系統 (CEM Corp.) 上以 0.10mmol 規模合成，使用 CarboMAX 偶聯和 一鍋法偶聯/脫保護法。在 DMF 中與 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma （5/10/5）在 105 °C 下偶聯 60 秒。通過直接添加 0.5 mL 的 25% 吡咯烷/DMF到偶聯后混合溶液中，開始脫保護步驟，并在排液前在 100 °C 下再繼續反應 40 秒。隨后進行一次 4 mL 洗滌。使用帶有 TFA/ H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統在 40°C 下進行切割 30 分鐘。切割后肽在冷乙酉迷中沉淀并凍干過夜。
多肽分析
在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統上分析未經任何純化的粗肽，該檢測器配備 Acquity UPLC BEH C8 色譜柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統連接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于結構測定。在 Waters MassLynx 軟件上進行峰分析。 使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進行分離。
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結果
與 CEM 的 Liberty Blue 自動化微波肽合成儀上使用的標準方法相比，Liberty PRIME 上的一鍋法偶聯/脫保護工藝生產出高純度肽，循環時間減少約 50%，化學廢物總量減少 66% 。Liberty PRIME 上 0.10 mmol 規模的標準循環在脫保護和隨后的偶聯之間使用 4mL 的單次洗滌，僅產生 8mL 化學廢物，總循環時間為 2 分 10 秒。表 1 顯示了在 Liberty PRIME 上合成的一組八種肽的粗純度、總合成時間和總化學廢物的實驗數據。
表1. Liberty PRIME上的多肽合
圖3. UPLC-MS Analysis of crude 65-74ACP.
圖4. UPLC-MS Analysis of crude ABC-20 mer.
圖5. UPLC-MS Analysis of crude JR-10 mer.
圖6. UPLC-MS Analysis of crude Exenatide.
圖7. UPLC-MS Analysis of crude 7-37GLP1.
圖8. UPLC-MS Analysis of crude PNIA(A10L).
圖9. UPLC-MS Analysis of crude Parigidin-br-1.
然后研究了 Liberty PRIME 上使用的高溫偶聯方法潛在的差向異構化。特別是已知在偶聯過程中對差向異構化敏感的半胱氨酸和組氨酸。差向異構化水平通過包括水解、隨后衍生化和氣相色譜分析（C.A.T. GmbH）等眾所周倁的標準方法進行研究。如表 2 所示，發現在室溫下使用 HBTU/DIEA 活化方法觀察到的差向異構化水平高于 90℃ 標準或 CarboMAX 偶聯以及 Liberty PRIME 上 105℃ CarboMAX 偶聯的差向異構化水平。使用 Fmoc- His(Boc)OH 代替 Fmoc-His(Trt)-OH 允許 90℃ 或 105℃ 的偶聯溫度，而差向異構化水平沒有任何增加。這些結果進一步證明了標準的 HE-SPPS 或 CarboMAX 偶聯方法特別適用于高溫下的肽合成。
表2. CarboMAX 偶聯方法的ABC-20mer 多肽中半胱氨酸和組氨酸的差向異構化水平
aFmoc-His(Trt)-OH; bFmoc-His(Boc)-OH; cFmoc-Cys(Trt)-OH.
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結論
Liberty PRIME 自動微波肽合成儀上使用的一鍋偶聯/脫保護方法能非常有效地合成各種肽。對所有 20 種氨基酸（包括半胱氨酸和組氨酸）使用了改進的 CarboMAX 偶聯化學的標準循環，極大簡化了序列優化需求。Liberty PRIME 2.0 的標準循環時間為 2 分鐘，是標準肽和復雜肽高通量合成的理想選擇，并且可以空偂地減少廢棄物產生。
引用
1 J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS)," Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.
2 Patent Pending: US20170226152; WO2017070512.
3 Patent Pending: US15686719; EP17188963.7; US20160176918; EP3037430; JP2016138090; CN105713066; AU2017204172.
4 CEM Corporation. CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature, 2018. CEM Corporation Website; Application Notes.
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